论文指导

低表面能防污涂层对微生物被膜群落结构的影响

摘    要:海洋生物污损(biofouling)主要由微生物腐蚀与生物淤积造成。微生物被膜(Biofilm)的形成为生物腐蚀提供了基础,也为生物淤积的发生创造了先决条件。抗生物附着材料是防止细菌定殖和微生物被膜形成的重要方式,其中低表面能防污涂层作为一种高效环保的抑膜方式,是近年来海洋防污损发展的重要方向之一。目前,低表面能防污涂料的研发取得了较多进展,但基于自然海域条件下对微生物被膜的抑制作用还有待进一步验证。基于已有方法的改进制备了一种有机硅低表面能防污涂料;随后利用16S rRNA测序方法对微生物被膜的群落组成、多样性、互作网络及潜在功能进行分析。结果表明:与周围海水相比,低表面能防污涂料能显著改变微生物被膜的微生物组成,降低了鞘氨醇单胞菌等的定殖。Chao 1指数和β-多样性也受到低表面能材料的明显扰动(P < 0.05)。互作网络分析显示,低表面能防污涂层增加了Biofilm群落的复杂性。此外,功能预测分析表明:该涂层表面微生物被膜生物群落的能量代谢与和成膜能力相关功能基因的丰度显著降低(P < 0.05)。综上,本研究制备了一种基于有机硅低表面能防污涂层,验证了其在自然海洋Biofilm中抑膜能力,并从微生物学上提供了证据。
 
关键词:低表面能防污涂层;海洋污损;微生物被膜;微生物结构;抑膜作用;
 
The influence of low surface energy antifouling coatings on marine biofilm
LI Qingchao CAI Zhonghua
ZHOU Jin
Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University
 
Abstract:
Marine biofouling was mainly caused by microbial corrosion. The formation of microbial biofilm provides environmental conditions for corrosion, which accelerates the biofouling process. The application of anti-biological adhesion and corrosion materials is an important way to prevent bacterial colonization and biofilm formation. Among the various methods, low surface energy antifouling coating is an efficient and environmentally friendly method. Its development and research has become an important approach of marine antifouling coating development in recent years. At present, many progress has been made in the research and development of low surface energy antifouling coatings, but its long-term anti-fouling effect under natural conditions needs to be further verified. In this work, we prepared an organosilicon low surface energy antifouling material and evaluated its anti-biofilm performance. The microbial community composition, biodiversity, interaction network and potential function were analyzed. The results showed that the biofilm composition on low surface energy antifouling coatings were obviously different from that of surrounding seawater (P<0.05), and the biggest difference was reduced the colonization of Sphingosine sp.. The Chao 1 index and β-diversity index were also disrupted by this material. The co-occurrence profiles proved that the low surface energy antifouling coating can increase the network complexity of community in biofilm. In addition, the function prediction showed that the functional genes abundance related to energy metabolism and film-forming process were changed significantly (P<0.05). Taken together, we prepared a kind of low surface energy antifouling material based on organosilicon compounds. The present study reveals that this coating have potential antifouling ability in natural marine environment, and provides us a new understanding about its antifouling mechanisms from the microbial perspective.
 
Keyword:
low surface energy coatings; marine biofouling; biofilms; microbial community; inhibitory biofilm function;
 
微生物被膜(Biofilm)在海洋环境中备受关注,它是导致海洋生物污损(marine biofouling)的先决条件[1]。海洋生物污损是指海洋中的动物、植物或微生物在海洋结构物表面附着、定殖、生长,从而导致海洋监测仪器、海底管道、海岸结构、船舶甚至跨海桥梁的腐蚀[2,3,4]。此外,附着的微生物随船舶航行被运输至其它海域,可能对当地生态平衡构成冲击,引发外来物种入侵的风险[5]。研究表明,海洋生物污损在世界范围内带来了巨大的经济损失和广泛的生态问题。如何抑制或减少生物污损的发生越来越受到人们的关注[6]。基于污损生物的附着与微生物被膜的形成相关密切,因此抑制微生物被膜的形成是一种潜在的抗污策略。
 
为了寻求一种高效、易加工、低成本的防污策略,近年来从材料科学和生态学的角度进行了诸多尝试[7,8]。传统的海洋防污技术主要包括杀菌剂涂层、防污漆、仿生材料、人工膜构建等,但这些方法存在成本较高、长期效果差、非环境友好和二次污染等不足[3,9,10,11,12,13]。相比之下,低表面能防污涂层由于其高效的抑制生物附着、定殖的特点而被大为推崇[14]。有研究指出以聚二甲基硅氧烷为主要原料的抗污涂层及其复合涂层、两亲性硅氧烷-聚氨酯涂层等低表面能涂层在短期条件下均具有不错的防污功效[15,16,17,18]。
 
然而,目前的研究多集中于低表面涂层的开发上,对其长期的抗污效果及真实环境下的成膜特性还相对缺乏[19]。本文拟通过研究典型低表面能防污涂层表面生物群落的多样性及组成、生物之间的互作关系及潜在功能,明晰该类型涂层在生物污损过程中的抑膜作用,为更好的认识污损行为和提高低表面能防污涂层的防污能力提供微生态学证据。
 
1 材料与方法
1.1 低表面能防污涂层的制备
本材料的制作参考自文献《无过渡层有机硅低表面能防污涂料的制备及性能研究》[20],并略做修改。防污涂料的组成可分为三个体系:体系A为主要成膜物质,由聚二甲基硅氧烷、二甲苯及硅油组成;体系B为固化剂,由正硅酸乙酯、无水乙醇及硅烷偶联剂组成;体系C为催化剂,由二月桂酸二丁基锡、乙酰丙酮及铂金催化剂组成。按确定质量比将体系A于烧杯中高速搅拌30 min,而后加入体系B中搅拌10 min,最后加入体系C充分搅拌后静置30 min得到防污涂料。获得的防污涂料原料组成如表1所示。制备的新鲜防污涂料于室温保存,一周内进行后续试验。
 
1.2 自然条件下的挂板试验
为考察防污涂层在实际海洋中的防污能力,将上述制得的涂料均匀涂于904L不锈钢板上(20 cm × 20 cm),厚度0.2 cm。将不锈钢板固定至绞架上自然风干48 h,并将其悬挂到大亚湾海上试验平台 (N22°38′17.54″, E114°05′52.35″)。根据Biofilm的形成周期,为评估防污涂层对不同时间Biofilm微生物群落组成及功能的影响,在试验开始(2020年11月15日)后的第0.5 d、1 d、3 d、7 d分别收集不锈钢板上的Biofilm样品。试验设计共分为三个组别:试验组A(低表面能防污涂层),空白对照B(无涂层),以及试验组C(安提夫新型环保防污涂料,作为阳性对照)。为了评估环境微生物的背景值,试验海域周围海水样品也在各个取样阶段同步采集(经0.22 µm滤膜过滤后得到)。不锈钢板上Biofilm用无菌海水微洗三次,去除未结合物质后用灭菌棉签刮取采集。每个组别设有4个生物学重复。样品命名以组别、采样时间和重复数为组合进行,例如试验组A的第一个平行样,在第1个时间点(0.5 d)、第2个时间点(1 d)、第3个时间点(3 d)、和第4个时间点(7 d)分别命名为A1.1、A2.1、A3.1、A4.1,其余平行样和组别的名称以此类推。
 
1.3 环境参数
试验期间利用EXO1 Multiparameter Sonde(YSI,USA)原位测量海水温度和盐度;使用FiveEasy Plus™(Mettler Teledo,Zurich Switzerland)测量pH值;用叶绿素荧光系统(Phyto-PAM,Walz,Germany)测定叶绿素a。采用间断化学分析仪(CleverChem Anna,Germany)测定磷酸盐(PO43-)、硝态氮(NO3-)、亚硝态氮(NO2-)和铵态氮(NH4+)。总有机碳(TOC)、总氮(TN)和总磷(TP)使用岛津TOC- vcph分析仪(日本)测定,测量环境指标时均有3次重复。
 
1.4 微生物被膜DNA的提取及扩增
使用DNeasy®PowerWater®Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取样品总DNA。将提取的DNA溶于100 μL Tris-EDTA缓冲液中,使用NanoDrop 2000分光光度计(OD260/OD230 >1.8)测定总DNA浓度[21]。
 
采用16S rRNA扩增技术分析生物被膜细菌群落。原核生物16S rRNA基因引物采用V4-V5 可变区(515 F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;907 R:5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′)。PCR反应体系包括1 μL正向引物(10 μmol/L)、1 μL反向引物(10μmol/L)、3 μL模板基因组DNA (20 ng/μL)、25 μL 2×Premix Taq反应液(Shenggong Biotechnology,Shanghai Co. Ltd,China)和20 μL无核酸酶水。PCR程序为:94 ℃初始化5 min,94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72 ℃延伸10 min,共30个循环。PCR产物用E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit试剂盒(Omega,USA)纯化,然后用Illumina HiSeq 2500平台构建文库并测序。
 
1.5 16S rRNA基因测序及分析
对所得到的64个样本(4个组别×4个时间×4个平行)进行测序,并对所测序的Biofilm样本进行分组。16S rRNA测序结果使用QIIME(版本1.9.1)和Mothur(版本1.35.1)进行分析[22,23]。操作分类单元(OTUs)的相似性阈值设置为97% [24]。根据Silva 16S rRNA数据库,采用80%阈值的RDP Classifier对每个OTU进行分类[25,26]。
 
基于16S rRNA基因扩增对其群落结构进行鉴定[27]。利用ussearch -alpha_div(V10,http://www.drive5.com/usearch/)计算稀疏曲线和α多样性(Shannon index、Chao 1 index)。基于Bray-Curtis不同相似性矩阵,采用非度量多尺度(NMDS)计算β多样性[28]。采用置换多变量方差分析(Permutational Multivariate analysis of Variance,PERMANOVA)评估不同孵育环境对方差的影响[29]。此外,利用CANOCO 5软件进行冗余分析(RDA),评价细菌群落组成与环境因子的关系[30]。
 
通过相互作用网络分析确定Biofilm微生物间的共发生模式[31]。在探讨关键物种在不同类群中的差异时我们进行了简化处理:将同一类群不同时间点的数据进行了混合。基于属的相对丰度,通过计算两两斯皮尔曼秩相关来分析共现网络。使用Gephi 0.9.2进行模块分析和网络可视化,网络的拓扑性质表征为节点数、平均路径长度、平均聚集系数、以及模块化指数图密度[32]。
 
为了评估低表面能涂层对Biofilm微生物功能的影响,采用PICRUSt (phylogeneticinvestigation of communities by reconstruction of unobserved states)在线软件(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)对微生物功能进行了预测。
 
1.6 统计分析
用于16S rRNA扩增子分析的方法描述于章节1.5中,以P值小于 0.05作为差异统计性依据。
 
1.7 数据可获得性
16S rRNA基因扩增数据集已上传至NCBI数据库,基因序列号为BioProject no.PRJNA784154。
 
2 结果与讨论
2.1 稀疏性及多样性
实验过程中低表面能组和对照组中微生物被膜中的多样性采用群落的稀疏性、α多样性指数和β多样性指数来评估。稀释曲线可直接反映测序量是否充分并间接反映样品的丰富度。由于测序过程中会产生数目庞大的OTU序列,当单个样本稀疏曲线末端趋向平缓时意味着测序深度达到可接受范围[33]。从测序结果的稀疏曲线可知(图1c),所有被测样品的丰富度随测序深度增加而变高,最后趋于稳定,表明所鉴定的序列数量达到了测序深度,可用于描述膜中的微生物区系[27]。
 
1.2 自然条件下的挂板试验
为考察防污涂层在实际海洋中的防污能力,将上述制得的涂料均匀涂于904L不锈钢板上(20 cm × 20 cm),厚度0.2 cm。将不锈钢板固定至绞架上自然风干48 h,并将其悬挂到大亚湾海上试验平台 (N22°38′17.54″, E114°05′52.35″)。根据Biofilm的形成周期,为评估防污涂层对不同时间Biofilm微生物群落组成及功能的影响,在试验开始(2020年11月15日)后的第0.5 d、1 d、3 d、7 d分别收集不锈钢板上的Biofilm样品。试验设计共分为三个组别:试验组A(低表面能防污涂层),空白对照B(无涂层),以及试验组C(安提夫新型环保防污涂料,作为阳性对照)。为了评估环境微生物的背景值,试验海域周围海水样品也在各个取样阶段同步采集(经0.22 µm滤膜过滤后得到)。不锈钢板上Biofilm用无菌海水微洗三次,去除未结合物质后用灭菌棉签刮取采集。每个组别设有4个生物学重复。样品命名以组别、采样时间和重复数为组合进行,例如试验组A的第一个平行样,在第1个时间点(0.5 d)、第2个时间点(1 d)、第3个时间点(3 d)、和第4个时间点(7 d)分别命名为A1.1、A2.1、A3.1、A4.1,其余平行样和组别的名称以此类推。
 
1.3 环境参数
试验期间利用EXO1 Multiparameter Sonde(YSI,USA)原位测量海水温度和盐度;使用FiveEasy Plus™(Mettler Teledo,Zurich Switzerland)测量pH值;用叶绿素荧光系统(Phyto-PAM,Walz,Germany)测定叶绿素a。采用间断化学分析仪(CleverChem Anna,Germany)测定磷酸盐(PO43-)、硝态氮(NO3-)、亚硝态氮(NO2-)和铵态氮(NH4+)。总有机碳(TOC)、总氮(TN)和总磷(TP)使用岛津TOC- vcph分析仪(日本)测定,测量环境指标时均有3次重复。
 
1.4 微生物被膜DNA的提取及扩增
使用DNeasy®PowerWater®Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取样品总DNA。将提取的DNA溶于100 μL Tris-EDTA缓冲液中,使用NanoDrop 2000分光光度计(OD260/OD230 >1.8)测定总DNA浓度[21]。
 
采用16S rRNA扩增技术分析生物被膜细菌群落。原核生物16S rRNA基因引物采用V4-V5 可变区(515 F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;907 R:5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′)。PCR反应体系包括1 μL正向引物(10 μmol/L)、1 μL反向引物(10μmol/L)、3 μL模板基因组DNA (20 ng/μL)、25 μL 2×Premix Taq反应液(Shenggong Biotechnology,Shanghai Co. Ltd,China)和20 μL无核酸酶水。PCR程序为:94 ℃初始化5 min,94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72 ℃延伸10 min,共30个循环。PCR产物用E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit试剂盒(Omega,USA)纯化,然后用Illumina HiSeq 2500平台构建文库并测序。
 
1.5 16S rRNA基因测序及分析
对所得到的64个样本(4个组别×4个时间×4个平行)进行测序,并对所测序的Biofilm样本进行分组。16S rRNA测序结果使用QIIME(版本1.9.1)和Mothur(版本1.35.1)进行分析[22,23]。操作分类单元(OTUs)的相似性阈值设置为97% [24]。根据Silva 16S rRNA数据库,采用80%阈值的RDP Classifier对每个OTU进行分类[25,26]。
 
基于16S rRNA基因扩增对其群落结构进行鉴定[27]。利用ussearch -alpha_div(V10,http://www.drive5.com/usearch/)计算稀疏曲线和α多样性(Shannon index、Chao 1 index)。基于Bray-Curtis不同相似性矩阵,采用非度量多尺度(NMDS)计算β多样性[28]。采用置换多变量方差分析(Permutational Multivariate analysis of Variance,PERMANOVA)评估不同孵育环境对方差的影响[29]。此外,利用CANOCO 5软件进行冗余分析(RDA),评价细菌群落组成与环境因子的关系[30]。
 
通过相互作用网络分析确定Biofilm微生物间的共发生模式[31]。在探讨关键物种在不同类群中的差异时我们进行了简化处理:将同一类群不同时间点的数据进行了混合。基于属的相对丰度,通过计算两两斯皮尔曼秩相关来分析共现网络。使用Gephi 0.9.2进行模块分析和网络可视化,网络的拓扑性质表征为节点数、平均路径长度、平均聚集系数、以及模块化指数图密度[32]。
 
为了评估低表面能涂层对Biofilm微生物功能的影响,采用PICRUSt (phylogeneticinvestigation of communities by reconstruction of unobserved states)在线软件对微生物功能进行了预测。
 
1.6 统计分析
用于16S rRNA扩增子分析的方法描述于章节1.5中,以P值小于 0.05作为差异统计性依据。
 
1.7 数据可获得性
16S rRNA基因扩增数据集已上传至NCBI数据库,基因序列号为BioProject no.PRJNA784154。
 
2 结果与讨论
2.1 稀疏性及多样性
实验过程中低表面能组和对照组中微生物被膜中的多样性采用群落的稀疏性、α多样性指数和β多样性指数来评估。稀释曲线可直接反映测序量是否充分并间接反映样品的丰富度。由于测序过程中会产生数目庞大的OTU序列,当单个样本稀疏曲线末端趋向平缓时意味着测序深度达到可接受范围[33]。从测序结果的稀疏曲线可知(图1c),所有被测样品的丰富度随测序深度增加而变高,最后趋于稳定,表明所鉴定的序列数量达到了测序深度,可用于描述膜中的微生物区系[27]。
 
2.2 微生物群落组成分析
测序中共获得660万条16S rRNA基因序列,共鉴定出27个门(phylum)。OUT分析显示:海水样品(SW)平均检测到934个可分类操作单元(OTUs),试验组A(含低表面能涂层)、空白组B(不含低表面能涂层)、以及商用涂层C(阳性对照组)生物膜样品分别检测到417个、510个和403个OTUs。
 
通过对16S rRNA基因的分类分析(图3a),发现相对丰度前五的优势门分别为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和巴氏杆菌门(Patescibacteria)。且变形菌门在海水生物群落及Biofilm群落中均占有主导地位,相对丰度均超过30%。厚壁菌门在Biofilm发育初期中丰度较高(10%-40%),随着膜的成熟其相对丰度逐渐降低。拟杆菌门在海水中占有17%-40%的相对丰度,然而其在Biofilm中的相对丰度较低。放线菌门在海水群落(SW)、空白组B及对照组C(商业涂层)中的相对丰度分别为6%-30%,1%-13%,以及3%-13%,而在试验组A(低表面能涂层)的相对丰度最低(0.8%-5%)。帕特西菌门在各组中的变化浮动较大,在各组中其变化范围在0.1%-24%之间。
 
进入属水平(genus),我们对一些具有代表性的类群进行了单变量分析,以显示更清晰的属水平群落变化(图3b)。从海水的背景值来看,不同时间(0.5 d,1 d,3 d 和7 d)的微生物群落组成不一致,显示背景值有时间差异性。在各试验组中,相对丰度前30的优势属中,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)、假丝酵母属(Candidatus Actinomarina)、溶胶芽胞杆菌属(Solbacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)和丛毛单胞菌属(Comamonas)的相对丰度较高。其中,溶胶芽胞杆菌属(10%-30%)和丛毛单胞菌属(3%-25%)在试验组A中的相对丰度较高,且在该组内随微生物被膜的发育时间的延长而减小。鞘氨醇单胞菌属在对照组B(8%-20%)和商业涂层组C(9%-47%)中的相对丰度较高,而在实验组A中的相对丰度最低(<1%)。此外,相比于空白组B和对照组C,低表面能组(A)能适当富集从毛单胞菌和芽孢杆菌。
 
本实验中我们发现生物群落在门水平上的分布与以往研究不同类型的浸泡人工基质上形成海洋生物膜的主要物种结果一致[27],这表明从大类上看不同环境下的微生物组成具有一定的同质性,证实了先前的观点“everything in everywhere”。水体环境中拟杆菌门是细菌群落的主导物种[40,41],而本次实验中我们发现在海水样品中拟杆菌门的丰度最高,这也佐证了前人的观点,即拟杆菌门更偏向于游离存在而粘附的较少[42]。相比之下,变形菌门具有更广泛的分布,其在游离态和附着态均很常见。变形菌门中的许多微生物如玫瑰杆菌(Roseobacter)、交替单胞菌(Alteromonas)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)等物种对水体环境中有机物反应迅速,在Biofilm的形成初期便成为先锋物种,定殖于结构物表面[43,44,45,46,47]。先锋物种附着在基质上,并在Biofilm中分泌代谢中间体,有助于多变环境下生物被膜的形成与发育[48]。这些物种为次级菌落提供营养和生态位,在微生物被膜形成的早期阶段起着至关重要的作用[49]。本次实验中我们发现在低表面能组A中,交替单胞菌(Alteromonas)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)相对丰度较低,证明制备的低表面能材料能抑制这些先锋物种的定殖,起到抑制膜的作用。此外,巴氏杆菌门的高丰度和高浮动在本次实验中被观察到,这可能与它的生态位依赖性有关,通常认为该微生物依赖于宿主来满足其基本代谢需求[50],我们推测在不同的时间点随着海流的交换和时间的演替,宿主生物(藻类、微型浮游动物)可能有较大的波动,这也是导致巴氏杆菌门丰度相对起伏的原因。另外,丛毛单胞菌经常被认为具有较强的环境应能力,且在试验组A中观察到前期丛毛单胞菌较多,而后期略有减少,这意味着低表面能防污涂层对该菌的抑制能力可能有限。在今后的研究中可采取针对性抑制丛毛单胞菌的措施,从而提升涂层整体的防污效果[51]。
 
2.3 环境因子对Biofilm的影响
为了探究环境因子在微生物被膜形成过程中所起的作用,我们测定了温度、盐度、pH、叶绿素a、总有机碳、总氮和总磷七个环境指标,其结果如表3所示。其中,温度、盐度、pH和叶绿素a的范围分别是24.30-25.10 ℃,32.53-33.37 ‰,8.24-8.52,0.32-1.83 µg/L;而总有机碳、总氮和总磷的浓度范围分别为7.38-8.15 mg/L,0.95-3.85 mg/L,0.49-0.85 mg/L。
 
通过冗余分析(RDA)探讨了环境因子对Biofilm细菌群落结构的影响。如图4所示主导型细菌群落与多种环境因子之间呈负相关,且总解释变量低于25%,这表明在膜形成期间环境条件的变化对群落组成影响有限[42]。事实上,在前人的不少工作中也发现,环境变量对微生物的影响解释率低于30%,包括藻际微生物、土壤微生物和水体微生物等[42,52],这表明理化参数对菌群的塑造作用有限。推测其它未关注到的因素,如水流、生物间的交互关系、代谢产物的影响等在期间可能会扮演权重更大的作用。同时,周集中等研究指出,微生物群落的组装机制,除了受环境因子等决定性过程影响外,随机过程(如漂变、随机扩散等)也参与其中[53]。这些结果暗示在本次实验中微生物差异形成的原因不仅仅源自环境参数,低表面能的材料性质也参与其中,这从侧面印证了它具有影响Biofilm的能力。
 
2.4 Biofilm生物之间的网络关系
为了研究低表面能对微生物被膜生物间网络关系的影响,我们计算了属与属之间的spearman相关系数(|r| > 0.8,P < 0.05),从而展示了显著类群的共发生模式(图5)。图中正相关和负相关的种属关系分别用红线和绿线表示。节点大小表示该属物种与其它物种联系的紧密程度,节点越大联系越紧密[54]。从图中可以看出,试验组A的正相关百分比高于空白组B、商业涂层组C和海水组。此外,试验组A的微生物群落边缘数量最多,说明低表面能涂层作用下增加了细菌群落的网络复杂性。
 
为了进一步了解物种之间的互作关系,我们计算了网络的拓扑结构参数,包含节点数、边数、平均链接度、平均聚类系数、模块化指数和网络密度。由表4可知,试验组A的节点数、边数、平均连接度及平均聚集系数均高于其它组。试验组A微生物群落中相关的节点数高于另外两组生物膜及海水,意味着该组相关联的属较多,说明试验组A细菌群落网络更加复杂[42]。较高的节点数和密度进一步验证了试验组A微生物网络的高复杂性,这对提升生态缓冲能力和微生物稳态至关重要[55,56,57]。试验组A、空白组B、商业涂层组C和海水组的模块化指数分别为0.490、0.291、0.303和0.542。当模块化指数为>0.4时,网络具有模块化结构,可以分为几个独立的组。因此,测试组A的网络结构较空白组B和商业涂层组C更紧密。以往的研究表明,环境压力会增加藻际环境中网络的复杂性;在压力条件下,微生物为了获得更多的生存机会而加强相互间的相互作用(包括信息交换、营养获取、合作行为等),从而使共生模式更加多样化[58,59]。这表明在低表面能材料的作用下,微生物受到了外来胁迫导致紧密关系增加,使得共发生网络相对复杂。
 
此外,试验组A中正相关关系的百分比更高,互作关系中节点数、边数、平均连接度及平均聚集系数均高于其它组,表明试验组A中微生物的相互协同、促进紧密,这种现象可以归因于外部压力的选择性,在低表面能防污涂层的作用下,试验组A上的微生物面临更大的生存压力[60,61,62],这或许是其Biofilm受到抑制的一种生态响应。
 
2.5 Biofilm潜在功能的变化
为了获得不同条件下Biofilm群落中微生物功能的差异,我们利用KEGG数据库对16S rRNA序列进行了在线功能预测(图6)。结果显示:在试验组A中富集较多的基因为K02013(ABC.FEV.A,铁复合体运输系统ATP结合蛋白[EC:7.2.2.-])、K02015(ABC.FEV.P,铁复合体运输系统渗透酶蛋白)、K02016(ABC.FEV.S,铁复合体运输系统底物结合蛋白)、K02033(ABC.PE.P,肽/镍转运系统渗透酶蛋白)、K03406(mcp,甲基接受趋化性蛋白)、K06147(ABCB-BAC ,ATP结合盒,B亚家族,细菌)。空白组B及商业涂层组C中富集较多的基因为K07090(无特征蛋白)、K00626(atoB,乙酰辅酶A C-乙酰转移酶[EC:2.3.1.9])、K00799(gst,谷胱甘肽S-转移酶[EC 2.5.1.18])、以及K02529(galR,LacI家族转录调控因子)。
 
在本研究中,运动趋化相关基因K03406在试验组A中的相对含量较空白组B、商业涂层组C及海水组高,这可能与培养过程中受到低表面能材料带来的环境压力有关。在低表面能材料存在下,细菌在其表面不易定殖;为了获得在不易定殖的材料表面的吸附能力,微生物强化了参与运动的一些功能基因,如趋化性基因。它是参与共生关系构建和膜形成的重要元件。有研究表明mcp基因(一种趋化基因)的缺失会减弱坂崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)形成生物被膜的能力[63,64]。此外基因K02013、K02015、K02016是与铁复合物运输系统相关的元件,这些基因在试验组A中富集从侧面反应了生物被膜受到了抑制。在膜受损的环境下微生物为了获得更多的铁元素,会增加铁代谢相关基因的表达,包括合成、运输或捕获。有研究表明,在缺少游离铁条件下微生物的成膜能力会受到抑制,而加入铁源后其成膜能力得到恢复[65]。此外,肽/镍转运系统渗透酶蛋白基因(K02033)也与生物成膜能力密切相关[66]。试验组A中K00626与K02529基因的丰度低于另外两组,这两类基因在能量合成与代谢过程中起着重要作用[67,68],此类信号因子与菌群群体感应(quorum sensing ,QS)调节系统密切相关。这研究表明群体感应相关的运输系统在氧化胁迫、盐度、紫外线辐射和饥饿等逆境条件下的细菌生存和生长的固定阶段起着关键作用[69,70,71,72],因此该类信号因子的丰度较低可能会直接影响生物膜的形成与发育。通过对功能基因预测分析可知,A组内与生物膜形成相关的基因丰度增高,与能量代谢相关的基因丰度降低。因此,低表面能防污涂层具有较好的抑膜效果。
 
3 结 论
本文经过自然条件下的挂板试验,对低表面能防污涂层的早期微生物被膜样本进行了分析,证实低表面能防污涂层生物群落与周围海水、空白组B及商业涂层组C具有较大差异,且α多样性及β多样性呈现一定的不同。环境因子关联分析结果显示生物被膜群落结构的组成与环境因子变化之间的联系并不紧密,说明成膜过程中环境因子对群落组成影响有限。网络分析显示低表面能涂层上生物群落互相协同及促进作用更加紧密,这可能是由于在压力条件下菌群关系自我调节所导致。功能基因预测分析显示低表面能涂层上与生物被膜形成相关的基因丰度增高,与能量代谢相关的基因丰度降低。综上可知,低表面能涂层在抑制生物被膜形成上具有一定的效果,但中长期的抑膜效果还有待进一步的验证。因此在今后的工作中,需要加强涂层防污时间效果的考虑,以及加强微生物被膜确切的功能应答机制(如宏基因组或宏转录组)。
 
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