论文指导

疑似中枢神经系统感染患者脑脊液病原体多重P

  吴婷娜 王旻晋 钟方财 郭硕 周妍冰 孟子芮 应斌武
  
  
  四川大学华西医院实验医学科 四川省内江市第一人民医院检验科
  
  
  摘    要:
  
  
  目的 分析脑膜炎/脑炎多重PCR(MEMP-19)检测技术检测疑似中枢神经系统(CNS)感染患者脑脊液病原体的结果。方法 选取2019年10-11月于四川大学华西医院就诊的208例患者的脑脊液标本,提取核酸,使用MEMP-19技术进行检测并对结果进行分析,统计病历和临床治疗信息。结果 208例脑脊液标本中,有43例检测出病原体,总检出率为20.67%。疑似CNS感染组病原体检出率为48.53%,其中EB病毒检出率最高(29.41%),新型隐球菌和结核分枝杆菌检出率分别为17.65%和10.29%。单一感染占63.64%(21/33),双重感染占30.30%(10/33),三重感染占6.06%(2/33)。非CNS感染组病原体检出率为7.14%,其中肠道病毒6例,EB病毒4例,均为单一感染。疑似CNS感染组MEMP-19阳性和阴性患者临床症状和脑脊液相关指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 MEMP-19技术可以快速、准确地对脑脊液中的多种病原体进行筛查、检测,有助于实验室及时为临床提供CNS感染的病原学依据。
  
  
  关键词:
  
  
  中枢神经系统感染 脑膜炎/脑炎多重PCR 脑脊液
  
  
  Analysis and study of multiple PCR results of cerebrospinal fluid pathogens in patients with suspected central nervous system infection
  
  
  WU Tingna WANG Minjin ZHONG Fangcai GUO Shuo ZHOU Yanbing MENG Zirui YING Binwu
  
  
  Department of Laboratory Medicine,West China Hospital of Sichuan University; Department of Clinical Laboratory,the First People′s Hospital of Neijiang;
  
  
  Abstract:
  
  
  Objective To analyze the results of meningitis/encephalitis multiple PCR(MEMP-19)in the detection of cerebrospinal fluid pathogens in patients with suspected central nervous system(CNS)infection.Methods The cerebrospinal fluid samples of 208 patients in West China Hospital of Sichuan University from October to November 2019 were selected,nucleic acid was extracted and detected by MEMP-19,and the results were analyzed,and the medical records and clinical treatment information were counted.Results Pathogens were detected in 43 out of 208 cerebrospinal fluid samples,with a total detection rate of 20.67%.The detection rate of pathogens in suspected CNS infection group was 48.53%,among which EB virus detection rate was the highest(29.41%),cryptococcus and mycobacterium tuberculosis detection rates were 17.65% and10.29%,respectively.Single infection accounted for 63.64%(21/33),double infection accounted for 30.30%(10/33),triple infection accounted for 6.06%(2/33).The pathogen detection rate of non CNS infection group was 7.14%,including 6 cases of enterovirus and 4 cases of EB virus,all of which were single infection.There was no significant difference in clinical symptoms and cerebrospinal fluid related indexes between MEMP-19 positive and negative patients in suspected CNS infection group(P>0.05).Conclusion MEMP-19 technology can quickly and accurately screen and detect a variety of pathogens in cerebrospinal fluid,which is helpful for the laboratory to provide etiological basis for central nervous system infection in time.
  
  
  Keyword:
  
  
  central nervous system infection; meningitis/encephalitis multiple PCR; cerebrospinal fluid;
  
  
  病原体侵入中枢神经系统(CNS)可引起感染性病变[1],严重时可导致患者死亡。因此,早期、准确地诊断CNS感染是临床治疗的关键。目前,CNS感染的病原体检测主要依靠脑脊液培养、涂片染色和特异性抗原抗体等方法,但检测的灵敏度和时效性较低。
  
  
  分子生物学诊断技术可以对病原体进行快速、准确的检测,有利于CNS感染病原体的鉴别与诊断。脑膜炎/脑炎多重PCR(MEMP-19)检测技术是将多重PCR扩增和毛细管电泳结合在一起的检测技术,能够针对19种临床常见的CNS感染病原体进行检测。与传统方法比较,有灵敏度、特异度、通量均高的优点[2-4]。本研究利用MEMP-19技术对疑似CNS感染患者的脑脊液病原体进行检测,现报道如下。
  
  
  1 资料与方法
  
  
  1.1 一般资料
  
  
  根据纳入标准筛选后将拟研究病例分为疑似CNS感染组(A组)与非CNS感染的其他神经系统病变组(B组),见图1。A组68例,为疑似CNS感染入院治疗的患者,临床表现有疑似CNS感染的症状或体征,如发热、头痛、意识改变等,伴或不伴脑脊液异常,脑脊液白细胞数≥5×106/L,蛋白浓度>0.45g/L;B组140例,包括颅内占位性病变、自体免疫性脑炎、神经系统退行性病变等临床诊断为非CNS感染性疾病的患者。所有患者入院时间为2019年10-11月。脑脊液标本收集纳入标准:(1)脑脊液标本量≥1mL,红细胞水平<10×1012/L;(2)脑脊液应在抗菌治疗或免疫制剂治疗前采集;(3)收集患者临床信息。
  
  
  1.2 仪器与试剂
  
  
  Easy-MAG核酸提取仪及其配套试剂购自上海梅里埃诊断产品有限公司;MEMP-19及其配套试剂购自宁波海尔施基因科技有限公司;ABI3500Genetic Analyzer、Applied Biosystems PCR扩增仪均购自美国赛默飞世尔科技公司。
  
  
  1.3 方法
  
  
  使用MEMP-19技术对纳入病例的脑脊液标本进行检测,包括19种CNS感染常见病原体:脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌(MTB)、单核细胞增生李斯特菌(LM)、肺炎链球菌、肺炎支原体(MP)、无乳链球菌、流感嗜血杆菌(HI)、大肠杆菌K1、肠道病毒(EVs)、人双埃可病毒、乙型脑炎病毒、水痘带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒(HSV)1型、HSV-2、EB病毒(EBV)、人类疱疹病毒6型及新型隐球菌(CN)。分析每种病原体的检出率,并分析患者的单一感染率和混合感染率。
  
  
  1.4 统计学处理
  
  
  采用SPSS17.0统计软件进行数据处理分析。计数资料以例数和百分率表示;组间比较采用四格表资料的χ2检验进行分析;当理论频数<5时,采用Fisher确切概率法进行分析;计量资料符合正态分布以表示,组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
  
  
  2 结果
  
  
  2.1 MEMP-19总检出率
  
  
  208例患者脑脊液标本中有43例检出至少1种病原体,总检出率为20.67%。EBV检出率最高(11.54%),其次是CN(5.77%)、MTB(3.37%)、EVs(3.37%)及HCMV(1.44%),HI、HSV-2、LM及MP的检出率均为0.48%。见表1。
  
  
  表1 208例患者脑脊液标本病原体检出情况(%)
  
  
  2.2 A组、B组检出率情况
  
  
  A组中有33例至少检出1种病原体,检出率为48.53%。主要是EBV(29.41%)、CN(17.65%)和MTB(10.29%);B组共检出6例EVs和4例EBV,检出率为7.14%。见表2。
  
  
  2.3 单一感染与混合感染结果
  
  
  A组的33例阳性标本中,单一感染21例(63.64%),双重感染10例(30.30%),三重感染2例(6.06%)。双重感染中,EBV与CN共感染5例、EBV与MTB共感染2例、EBV与HCMV共感染1例、MTB与HCMV共感染1例、EVs与CN共感染1例;三重感染中,EBV、MTB及HCMV共感染1例,EBV、CN及MP共感染1例;B组10例均为单一感染。见表3。
  
  
  表2 两组脑脊液病原体检出情况(%)
  
  
  表3 A组单一感染与混合感染的脑脊液病原体分布(n)
  
  
  2.4 A组MEMP-19检测阳性和阴性患者的临床表现及脑脊液指标比较
  
  
  A组MEMP-19检测阳性和阴性患者在发热、头痛、恶心呕吐、意识改变、抽搐和脑膜刺激征方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05),在脑脊液有核细胞计数及脑脊液总蛋白水平比较,差异亦无统计学意义(P>0.05)。见表4。
  
  
  表4 A组MEMP-19检测阳性和阴性患者的临床表现及脑脊液指标情况
  
  
  续表4 A组MEMP-19检测阳性和阴性患者的临床表现及脑脊液指标情况
  
  
  3 讨论
  
  
  CNS感染是一种常见的感染性疾病,起病急、病情重且进展迅速[5]。常规实验室检查或临床症状分析,难以准确诊断CNS感染的病原体。当前,分子生物学诊断技术正快速发展并应用于CNS感染病原体的实验室检测中,但仍存在诸多不足。实时荧光定量PCR可在较短时间内对一种或几种已知病原体进行快速定性检测,但无法用于病原体的高通量筛查;而基于新一代高通量测序技术的病原体检测,可大幅提高对病原体的筛查、检测能力[6],但其需要专业的检测平台和人员[7],且价格较为昂贵。本研究首次利用MEMP-19试剂盒对四川大学华西医院208例患者的脑脊液标本进行了病原体检测,在疑似CNS感染组中有48.53%的患者检出病原体,并发现共感染情况。
  
  
  本研究中A组检出的病原体以EBV(29.41%)和HCMV(4.41%)较为常见,且存在单一感染和共感染并存的情况,这与既往CNS共感染相关研究一致[8-10]。此外,有研究显示,EBV和HCMV是常见的机会性感染病原体[11-12],可累及多器官系统出现临床症状和持续感染,免疫力低下患者,尤其是合并人类免疫缺陷病毒感染的患者,应考虑EBV和HCMV潜伏感染的可能[13-14]。故仅脑脊液EBV和HCMV检测阳性并不能诊断CNS感染,必须结合临床症状综合考虑。
  
  
  此外,A组CN检出率为17.65%,12例检出CN的患者中,5例单一感染,7例共感染。CN为条件致病性真菌,是免疫功能低下患者CNS感染常见的病原体[15],在免疫功能低下患者出现CNS感染症状时,应考虑隐球菌性脑膜炎的可能。
  
  
  结核性脑膜炎是最严重的肺外MTB感染所致的疾病之一[16]。本研究中A组共检出7例MTB,检出率为10.29%,它们的常规脑脊液培养和抗酸染色检测结果为阴性。由于结核性脑膜炎的非特异性临床表现增加了临床诊疗难度,因此病原学检测对结核性脑膜炎的临床诊断非常重要,而传统的MTB检测主要是抗酸染色镜检及培养,检出率低且培养耗时。因此,MEMP-19检测非常适用于MTB的临床快速筛查和检测。
  
  
  除此之外,A组还检出HI、LM、MP等病原体,但常规脑脊液培养均为阴性。结合临床症状及随访治疗效果进行分析,确认MEMP-19的检测结果可信。这充分证明了MEMP-19相比传统的实验室检测方法,能够更加准确地对疑似CNS感染病例的脑脊液病原体进行检测。结合临床信息进行分析发现,A组MEMP-19阳性和阴性的患者在临床症状和体征,以及脑脊液生化指标方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),这与伊洁等[17]报道的结果一致,提示MEMP-19检测结果与患者的临床表现没有相关性,而可能与感染病原体毒力和机体免疫力有关。
  
  
  值得注意的是,本研究中B组检出EVs及EBV。研究显示,EVs等嗜神经性病毒可建立CNS持续性感染,如脊髓灰质炎病毒RNA在感染数年后仍能在脑脊液中检测到[18]。最近一项研究证明在CNS感染中持续检测到EVs序列与肌萎缩侧索硬化的恶性发展相关[19]。也有报道显示,EBV在其原发感染后即建立终身潜伏感染并潜伏于B淋巴细胞,由此可在无CNS感染临床症状时检测到[20]。因此,临床需重视病原体在CNS中的潜伏感染和引起相关并发症的情况。
  
  
  本研究显示,MEMP-19对脑脊液病原体有较好的检出效果,其耗时短、特异性强且能同时检测多种病原体,因而可为临床提供早期、快速、可靠并且更加全面的病原学检测结果,可提高CNS感染的临床诊断效能。与传统的病原体检测手段比较,MEMP-19检测CNS感染为实验室诊断提供了新思路。
  
  
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