论文指导

贝伐珠单抗对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞功能

摘    要:
目的 研究贝伐珠单抗对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡及PTEN/AKT信号通路的影响。方法 ARPE-19细胞分为空白组(正常DMEM培养液培养)、模型组(200μmol·L-1 H2O2)、低剂量实验组(200μmol·L-1 H2O2+0.125 mg·mL-1贝伐珠单抗)、高剂量实验组(200μmol·L-1 H2O2+1.25 mg·mL-1贝伐珠单抗)、SF1670组(200μmol·L-1 H2O2+2μmol·L-1 SF1670)、SF1670+高剂量实验组(200μmol·L-1H2O2+2μmol·L-1SF1670+1.25 mg·mL-1贝伐珠单抗)。以CCK-8法检测细胞ARPE-19存活率,以流式细胞术检测ARPE-19细胞凋亡率,以DCFH-DA荧光探针法检测细胞中活性氧(ROS)水平,检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,以蛋白质印迹法检测ARPE-19细胞凋亡相关及PTEN/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。结果 给药24 h,空白组、模型组和低、高剂量实验组ARPE-19细胞存活率分别为(98.79±3.57)%,(52.36±2.14)%,(76.74±3.72)%,(91.23±2.19)%;凋亡率分别为(3.64±0.52)%,(15.47±3.15)%,(9.14±1.77)%,(6.82±0.69)%;给药24 h,模型组、SF1670组、SF1670+高剂量实验组ARPE-19细胞存活率分别为(53.95±4.12)%,(80.14±2.95)%,(96.12±1.92)%;凋亡率分别为(16.31±2.66)%,(10.96±1.94)%,(5.58±2.38)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组ROS荧光强度、SOD活性、MDA含量、Bax和Bcl-2蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 贝伐珠单抗可明显减少H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞活力的损伤和细胞凋亡,其作用机制可能与促进PTEN/AKT信号通路相关蛋白转导有关。
 
关键词:
贝伐珠单抗 视网膜色素上皮细胞 细胞增殖 细胞凋亡 氧化应激
 
Effect of bevacizumab on the function of retinal pigment epithelial cells induced by H2O2
YUAN Jian-shu PAN Su-qi LAN Bi-fei
Department of Ophthalmology,Ningbo Eye Hospital;
Abstract:
Objective To study the effect of bevacizumab on the apoptosis of retinal pigment epithelial cells induced by H2O2 and the PTEN/AKT signaling pathway. Methods ARPE-19 cells were divided into blank group(DMEM), model group(200 μmol·L-1 H2O2), Exp-L group(200 μmol·L-1 H2O2+0.125 mg·mL-1 bevacizumab), Exp-H group(200 μmol·L-1 H2O2+1.25 mg·mL-1 bevacizumab), SF1670 group(200 μmol·L-1 H2O2+2 μmol·L-1 SF1670), SF1670+Exp-H group(200 μmol·L-1 H2O2+2 μmol·L-1 SF1670+1.25 mg·mL-1 bevacizumab). CCK-8 method was used to detect cell survival rate of ARPE-19, flow cytometry was used to detect ARPE-19 cell apoptosis rate,DCFH-DA fluorescent probe method was used to detect cell reactive oxygen species( ROS) level,detect the Superoxide dismutase( SOD) activity and Malondialdehyde( MDA) content.Western blotting was used to detect the expression of ARPE-19 cell apoptosis-related and PTEN/AKT signaling pathway related proteins. Results After 24 hours of administration,the survival rates of ARPE-19 cells in blank group,model group, Exp-L group and Exp-H group were( 98. 79 ± 3. 57) %,( 52. 36 ± 2. 14) %,( 76. 74 ± 3. 72) %,( 91. 23 ± 2. 19) %; apoptosis rates were( 3. 64 ± 0. 52) %,( 15. 47 ± 3. 15) %,( 9. 14 ± 1. 77) %,( 6. 82 ± 0. 69) %,respectively. After 24 hours of administration,the survival rates of ARPE-19 cells in model group,SF1670 group,and SF1670 + Exp-H group were( 53. 95 ± 4. 12) %,( 80. 14 ± 2. 95) %,( 96. 12 ± 1. 92) %; apoptasis rates were( 16. 31 ± 2. 66) %,( 10. 96 ± 1. 94) %,( 5. 58 ± 2. 38) %,all with significant difference( all P < 0. 05). The ROS,SOD activity,MDA content,relative expression of Bax protein and Bcl-2 protein in each group were all with significant differences( all P < 0. 05). Conclusion Bevacizumab can significantly reduce the damage and apoptosis of retinal pigment epithelial cells induced by H2O2,and its mechanism of action may be related to the promotion of protein transduction in the PTEN/AKT signaling pathway.
 
Keyword:
bevacizumab; retinal pigment epithelial cell; cell proliferation; cell apoptosis; oxidative stress;
 
视网膜损伤是致盲的重要原因之一,尤其是年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration, AMD)引起的视网膜色素上皮细胞损伤是造成人类视力受损的主要原因[1]。AMD发病早期常伴随着视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤,进而引起细胞凋亡[2]。贝伐珠单抗是最早用于临床的抗血管新生单克隆抗体,具有显著的抗肿瘤作用[3]。本研究通过观察贝伐珠单抗对过氧化氢诱导人视网膜色素上皮细胞活力损伤和凋亡的影响,探讨贝伐珠单抗在延缓AMD方面的作用。
 
材料与方法
1 材料
细胞 人视网膜色素上皮细胞ARPE-19,购自美国ATCC公司。
 
药品与试剂 贝伐珠单抗,纯度:99.40%,批号:A2006;SF1670,纯度:99.01%,批号:SF31001,均为美国Selleck有限公司生产。DMEM培养基,购自美国Hyclone公司;胎牛血清(FBS),购自美国Gibco公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒,均购自上海碧云天生物技术有限公司;DCFH-DA荧光探针,购自美国Sigma公司;细胞计数试剂盒-8(CCK-8);Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒,二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒,均购自北京索莱宝科技有限公司;鼠抗人Bcl-2、Bax多克隆抗体,均购自美国Cell Signaling公司。
 
仪器 550酶标仪,美国Bio-Tek公司产品;Amoaf 1000细胞自动计数仪,美国Invitorgen公司产品。
 
2 实验方法
2.1 细胞培养与分组
细胞培养 ARPE-19细胞培养在含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养液中,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中,2~3 d用0.25%的胰酶消化,传代。取对数生长期、状态良好的细胞用于实验研究。
 
分组情况:①空白组(正常DMEM培养液培养),模型组(200 μmol·L-1 H2O2),低剂量实验组(200 μmol·L-1H2O2+0.125 mg·mL-1贝伐珠单抗)和高剂量实验组(200 μmol·L-1 H2O2+1.25 mg·mL-1贝伐珠单抗);②模型组(200 μmol·L-1 H2O2),SF1670组(200 μmol·L-1 H2O2+2 μmol·L-1 SF1670),SF1670+高剂量实验组(200 μmol·L-1 H2O2+2 μmol·L-1 SF1670+1.25 mg·mL-1贝伐珠单抗)。
 
2.2 以CCK-8法检测ARPE-19细胞增殖[4]
取对数生长期细胞,用胰酶消化,以制作细胞悬液,调整细胞浓度每孔3×103个接种于96孔板中,药物处理24 h后吸取旧培养基,每孔加入CCK-8溶液10 μL,将培养板置于培养箱内孵育1~4 h, 用酶标仪在450 nm处测定光密度(OD)值,细胞存活率=(OD实验组/OD对照组)×100%。
 
2.3 以流式细胞仪检测ARPE-19细胞凋亡情况[5]
调整对数期ARPE-19细胞密度为每孔3×104个/孔接种于24孔板中,细胞分组同2.1。给药24 h后,胰酶消化,收集细胞。PBS溶液清洗2次,参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
 
2.4 ARPE-19细胞内活性氧类水平测定[6]
调整对数期ARPE-19细胞密度为每孔2×105个/孔接种于6孔板中,细胞分组同2.1。经处理后各组细胞继续培养24 h, PBS洗涤,加入含有20 μmol·L-1 DCFH-DA的PBS,37 ℃孵育2 h, 在流式细胞仪检测各组活性氧自由基生成量。
 
2.5 ARPE-19细胞内ROS、MDA、SOD水平测定[7]
调整对数期ARPE-19细胞密度为每孔2×105个/孔接种于6孔板中,细胞分组同2.1。经处理后各组细胞继续培养24 h, 离心收集细胞,反复冻融,取上清检测各组细胞ROS、MDA、SOD水平,严格按照试剂盒操作说明书进行。
 
2.6 以蛋白质印迹法检测ARPE-19细胞相关蛋白表达情况[8]
调整对数期ARPE-19细胞密度为每孔2×108个/孔接种于10 cm皿中,细胞分组同2.1。处理后各组细胞继续培养24 h, 培养结束后,胰酶消化,收集细胞。RIPA试剂提取细胞中总蛋白,BCA法测定蛋白含量,以每孔20 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后,湿转至PVDF膜,并于5 %脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分组①分别加入Bcl-2、Bax和GAPDH一抗,分组②分别加入PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT和GAPDH一抗,4 ℃孵育过夜。加对应的辣根过氧化酶标记的二抗,37 ℃孵育1 h。加化学发光试剂,避光显影,曝光拍照。
 
3 统计学处理
数据用SPSS.22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用x¯±s表示,2组间比较用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析。
 
结 果
1 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞增殖的影响
干预24 h, 空白组、模型组和低、高剂量实验组细胞存活率分别为(98.79±3.57)%,(52.36±2.14)%,(76.74±3.72)%,(91.23±2.19)%。空白组相比较,模型组细胞存活率明显降低(P<0.05);与模型组相比较,各剂量实验组细胞相对存活率明显增加(P<0.05),且随着贝伐珠单抗作用浓度的增加细胞存活率逐渐升高,呈现出浓度依赖性。
 
2 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞凋亡的影响
干预24 h, 空白组、模型组和低、高剂量实验组细胞凋亡率分别为(3.64±0.52)%,(15.47±3.15)%,(9.14±1.77)%,(6.82±0.69)%。与空白组相比较,模型组细胞凋亡率明显增加(P<0.05);与模型组相比较,各剂量实验组细胞相对凋亡率明显降低(P<0.05),且随着贝伐珠单抗作用浓度的增加细胞凋亡率逐渐降低,呈现出浓度依赖性。
 
3 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞凋亡相关蛋白表达的影响
空白组、模型组及低、高剂量实验组中Bax 蛋白相对表达量分别为0.28±0.12,0.97±0.25,0.48±0.19,0.21±0.24;Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.95±0.22,0.17±0.12,0.56±0.28,0.81±0.17。与空白组比较,模型组细胞Bax蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低(均P<0.05);与模型组相比较,低、高剂量实验组细胞Bax蛋白相对表达量降低,且贝伐珠单抗作用浓度增大逐渐降低,Bcl-2蛋白表达量升高(均P<0.05),呈现出浓度依赖性,见图1。
图 1 蛋白质印迹法检测贝伐珠单抗对ARPE-19细胞凋亡相关蛋白表达的影响
4 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞ROS、SOD、MDA表达的影响
与空白组相比,模型组细胞ROS、MDA水平显著增加,SOD水平显著降低(均P<0.05);与模型组相比较,各剂量实验组细胞ROS、MDA水平显著降低,SOD水平显著增加(均P<0.05),呈现出浓度依赖性,见表1。
 
5 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞PTEN/AKT信号通路相关蛋白表达的影响
空白组、模型组及低、高剂量实验组PTEN蛋白相对表达量分别为0.23±0.17,0.92±0.19,0.54±0.23,0.35±0.18;p-PI3K蛋白相对表达量分别为1.19±0.11,0.42±0.13,0.71±0.13,0.99±0.17;p-AKT蛋白相对表达量分别为0.89±0.08,0.26±0.26,0.52±0.13,0.82±0.16。与空白组比较,模型组细胞PTEN蛋白表达升高,p-PI3K和p-AKT蛋白表达降低(均P<0.05);与模型组相比较,低、高剂量实验组细胞PTEN蛋白表达降低,p-PI3K和p-AKT蛋白表达升高(均P<0.05),见图2。
 
表1 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞内ROS、SOD、MDA水平的影响(x¯±s)
6 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞增殖和凋亡的影响
与模型组相比较,SF1670组细胞存活率增加,细胞凋亡率降低(均P<0.05);与SF1670组相比较,SF1670+高剂量实验组细胞存活率增加,细胞凋亡率降低(均P<0.05),见表2。
 
7 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞ROS、SOD和MDA表达的影响
与模型组细胞相比较,SF1670组细胞ROS、MDA水平显著降低,SOD水平显著升高(均P<0.05);与SF1670组相比较,SF1670+高剂量实验组细胞ROS、MDA水平显著降低,SOD水平显著增加(均P<0.05),呈现出浓度依赖性,见表3。
 
8 贝伐珠单抗通过PTEN/AKT信号通路对ARPE-19细胞凋亡蛋白的影响
 
图 2 蛋白质印迹法检测贝伐珠单抗对ARPE-19细胞PTEN/AKT信号通路相关蛋白表达的影响
表2 贝伐珠单抗对ARPE-19细胞增殖和凋亡的影响(x¯±s)
表3 贝伐珠单抗通过PTEN/AKT信号通路影响ARPE-19细胞凋亡(x¯±s)
模型组、SF1670组和SF1670+高剂量实验组细胞Bax蛋白相对表达量分别为0.96±0.19,0.64±0.11,0.31±0.21;Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.19±0.08,0.62±0.15,1.02±0.25。与模型组相比较,SF1670组Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05);与SF1670组相比较,SF1670+高剂量实验组Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05),见图3。
 
图 3 蛋白质印迹法检测ARPE-19细胞凋亡相关蛋白表达情况
讨 论
本实验中,用200 μmol·L-1 H2O2建立视网膜色素上皮细胞氧化应激模型,观察贝伐珠单抗对视网膜色素上皮细胞的保护作用。实验结果表明200 μmol·L-1 H2O2引起ARPE-19细胞活力降低、细胞凋亡率增加,而贝伐珠单抗作用下,细胞增殖率随着贝伐珠单抗浓度的升高而升高,细胞凋亡率随着贝伐珠单抗浓度的升高而降低,证实贝伐珠单抗对ARPE-19细胞的保护作用。且研究发现,H2O2可诱导ARPE-19细胞中ROS、MDA含量升高,SOD量下降,而贝伐珠单抗可剂量依赖性地逆转这一反应。
 
PTEN是PI3K/AKT信号通路上重要的负调控因子,可诱导PI3K中间产物三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)脱磷酸而失活,进而抑制PI3K下游基因AKT磷酸化活化,从而调控下游多种靶蛋白表达而参与调控细胞生长、凋亡过程。本研究发现,H2O2可诱导ARPE-19细胞中PTEN蛋白高表达,抑制PI3K/AKT蛋白活性,而贝伐珠单抗可逆转此反应,这提示贝伐珠单抗对ARPE-19细胞的生物学作用可能是通过调控PTEN/AKT信号通路。用PTEN蛋白的特异性抑制剂SF1670抑制PTEN蛋白的表达,结果表明,抑制PTEN蛋白后,H2O2诱导的ARPE-19细胞活性增加、凋亡率降低且氧化反应减少,而加入贝伐珠单抗后促进这一反应,这表明贝伐珠单抗通过调控PTEN/AKT信号通路进而抑制H2O2诱导的ARPE-19细胞凋亡进程。
 
贝伐珠单抗对于氧化应激所引起的人视网膜色素上皮细胞的损伤具有保护作用,其作用可能与调控PTEN/AKT信号通路的活性有关。
 
参考文献
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